肺癌是對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。近年來，肺癌的發(fā)病率在多數(shù)國家呈現(xiàn)明顯增高的跡象，其中，非小細胞肺癌（NSCLC）占比約85%。目前，基因測序技術(shù)已在NSCLC診斷、靶向治療、預后研究中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

在過去的20年里，雖然全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）已經(jīng)將40余個遺傳位點與NSCLC聯(lián)系起來，但前期大多數(shù)研究都是基于歐洲人群進行的，目前仍缺乏對于中國人群的大規(guī)模研究，并且基于基因陣列插補的傳統(tǒng)GWAS仍然存在一定的局限性。首先，基因陣列只覆蓋了部分基因組變異，對于基因組中其他基因變異的推斷依賴于插補技術(shù)，因此其準確性依賴人群匹配且更全面的單倍型參考基因面板（panel）。其次，基因陣列插補只適用于常見的低頻變異，無法準確分析罕見致病變異。

為解決上述難題，近日，南京醫(yī)科大學沈洪兵/胡志斌團隊對來自南京肺癌隊列（NJLCC）的2984例NSCLC病例和3020例無癌對照進行了大規(guī)模全基因組測序（WGS），鑒定了20余個NSCLC相關(guān)的常見致病性突變，其中5個為新發(fā)現(xiàn)致病變異，并發(fā)現(xiàn)DNA修復基因中的罕見功能缺失變異以及BRCA2啟動子中的罕見變異增加了非小細胞肺癌風險。相關(guān)研究成果已發(fā)表在Cancer Cell上，文章題為“Analyses of rare predisposing variants of lung cancer in 6,004 whole genomes in Chinese”。

將WGS技術(shù)應用于中國人群肺癌致病變異的鑒定不僅可以構(gòu)建中國人群的特異性單倍型基因參考數(shù)據(jù)庫，提高常見和低頻變異插補的準確性和覆蓋度，增加發(fā)現(xiàn)新易感變異的可能性，還可以為系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)肺癌罕見致病變異提供信息。

文章發(fā)表在Cancer Cell

主要研究內(nèi)容

NSCLC和無癌對照個體的種系變異概述

首先，研究人員對從NJLCC招募的3043名NSCLC患者和3084名無癌對照者進行了WGS。通過嚴格的數(shù)據(jù)質(zhì)控，最終共有2984例NSCLC患者和3020例對照個體被納入后續(xù)分析流程，并確定了100565590個短小變異，包括91942266個單核苷酸變異（SNV）和8623324個小片段插入或缺失（INDEL）。其中，8.79%的SNV和12.56% 的INDEL被認為是常見、低頻變異，其它絕大多數(shù)為罕見變異，并且68.59%的罕見變異未收錄在gnomAD數(shù)據(jù)庫中。

圖1. 整體研究流程示意圖，來源：Cancer Cell

鑒定出5個新的NSCLC常見和低頻易感位點

研究人員按組織學類型（肺腺癌和肺鱗狀細胞癌）、性別（男性和女性）或吸煙狀況（吸煙者和終生不吸煙者）對整體NSCLC和亞組進行了關(guān)聯(lián)分析，共發(fā)現(xiàn)20個位點可以達到全基因組顯著性水平。在這20個位點中，有5個位點未被報道過，其中2個基因位點與整體NSCLC的風險有關(guān)。同時，這5個變異位點與NSCLC風險的關(guān)聯(lián)也在另外的獨立隊列中得到了驗證，該隊列包括2018例患者和2392例非癌癥對照。

圖2. 全基因組關(guān)聯(lián)分析鑒定五個顯著性易感位點，來源：Cancer Cell

為了確定5個未被報道的NSCLC相關(guān)位點的功能相關(guān)基因，研究團隊利用NSCLC中國患者的116個相鄰正常肺組織的基因型和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，構(gòu)建了肺組織特異性表達定量性狀位點（eQTL）數(shù)據(jù)庫。對于先前未報道的2個具有共同變異的位點和先前報道的五個獨立共同變異的位點，通過整合NJLCC eQTL數(shù)據(jù)集和GWAS數(shù)據(jù)集，進行了位點級GWAS-eQTL共定位分析。最終確定這些變異位點與SRC、DSP、RGL2、BTN3A2和CCDC116相關(guān)聯(lián)。

圖3. NSCLC高危位點的潛在易感基因的鑒定，來源：Cancer Cell

BRCA2、癌癥易感基因和DNA損傷修復途徑基因中罕見致病性LOF負荷增加

在對編碼序列中罕見變異（MAF<0.5%）的深入分析中，研究團隊共納入了3268個至少有3個LOF變異的基因。結(jié)果顯示，BRCA2具有最高的信號，在經(jīng)過多次校正后，其風險相關(guān)性仍然顯著。在NSCLC個體中，研究人員在BRCA2的標準轉(zhuǎn)錄本中鑒定出22個LOFs變體，其中14個P/LP變體在ClinVar數(shù)據(jù)庫中有記錄，其他8個沒有記錄。更加有意思的是，在NSCLC個體中發(fā)現(xiàn)的BRCA2的LOFs變體主要位于RAD51的結(jié)合位點。

除BRCA2外，肺癌患者中其他10個CpG的LoF變異負荷也高于非癌癥對照組，包括RAD50、ATM、FANCA、ERCC6、RAD51D、FANCM、WRN、CHEK2、NBN及MRE11A。進一步分析發(fā)現(xiàn)，LoF負荷增加的15個CpG參與了DNA損傷修復（DDR）過程。

圖4. 罕見LOF變異與NSCLC風險的相關(guān)性分析，來源：Cancer Cell

調(diào)控區(qū)域的罕見功能變異與NSCLC的風險相關(guān)

在基于啟動子的關(guān)聯(lián)分析中，研究團隊共納入了10041個至少有3個功能變異的基因，發(fā)現(xiàn)BRCA2啟動子區(qū)與肺癌風險存在顯著相關(guān)性。BRCA2啟動子與NSCLC風險之間的關(guān)系在包含2018例患者和2392例對照的獨立隊列中也得到了驗證。此外，研究人員在一個獨立的前瞻性隊列中對BRCA2啟動子區(qū)進行了Sanger測序，該隊列有23826名參與者（包括301名新診斷為NSCLC的個體），并觀察到一致的關(guān)聯(lián)性。

圖5. BRCA2啟動子區(qū)域與NSCLC風險的相關(guān)性分析，來源：Cancer Cell

 

結(jié) 語

綜上所述，該研究通過WGS和SNP基因分型，構(gòu)建完成了迄今為止中國人群中最大規(guī)模、最全面的胚系變異及其與NSCLC關(guān)聯(lián)的分析結(jié)果。利用高深度的WGS數(shù)據(jù)，研究團隊構(gòu)建了高質(zhì)量的單倍型參考面板，并基于WGS和人群特異性的分析策略對常見和低頻變異進行單變異關(guān)聯(lián)分析，確定了5個新的NSCLC風險相關(guān)全基因組顯著位點，并進一步揭示了5個高置信度易感基因：SRC、DSP、RGL2、BTN3A2和CCDC116。

此外，通過完善的轉(zhuǎn)錄本表達和功能優(yōu)先排序策略，研究人員在全基因組尺度上系統(tǒng)評估了NSCLC罕見易感變異的致病性，并證明LOF變體破壞BRCA2或DDR通路顯著增加NSCLC的風險。此外，除了編碼區(qū)域的變異體，研究結(jié)果還提供了非編碼變異體對疾病的影響，例如BRCA2啟動子變異和FAAP100增強子變異，可以對NSCLC的風險產(chǎn)生強烈影響。

圖6. 整體研究概圖，來源：Cancer Cell

基于WGS的研究極大地提高了基于大規(guī)模人群隊列的遺傳研究效率，而且有助于描繪罕見致病變異的全貌，拓寬領(lǐng)域內(nèi)對肺癌遺傳病因?qū)W的認識，為肺癌的精準預防、治療等提供重要參考。

參考文獻：

Wang et al., Analyses of rare predisposing variants of lung cancer in 6,004 whole genomes in Chinese, Cancer Cell （2022）.DOI:https://doi.org/10.1016/j.ccell.2022.08.013

https://www.cell.com/cancer-cell/fulltext/S1535-6108(22)00377-4