隨著干細胞技術(shù)的不斷進步，源自人誘導多功能干細胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs）的腦類器官已成為疾病模型中的熱門話題。腦類器官有望為藥物篩選、精準醫(yī)學、神經(jīng)修復等領(lǐng)域帶來新的發(fā)展契機。

腦類器官的優(yōu)勢體現(xiàn)在下面兩個方面：

 

-與二維細胞培養(yǎng)相比

腦類器官能體現(xiàn)出神經(jīng)元組織的復雜特征，比如皮質(zhì)層結(jié)構(gòu)、細胞類型多樣性等。

 

-與動物模型相比

腦器官能保留患者個體的遺傳背景差異。此外，在小鼠皮層中植入的人腦類器官可以發(fā)生血管化，以此供應(yīng)營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，防止類器官核中發(fā)生細胞壞死，并能將神經(jīng)軸突延伸到周圍的宿主組織中。

2022年10月16日，曾解讀了斯坦福大學帕斯卡團隊在Nature上發(fā)表的一篇重磅論文。該文以《Maturation and circuit integration of transplanted human cortical organoids》為題，報道了一種人鼠混合大腦類器官，為大腦神經(jīng)退行性疾病研究和新藥開發(fā)提供了新的策略。（文章回顧：Nature重磅：人鼠混合大腦問世，‘大腦類器官’研究再添新進展）

圖片來源：Nature 610, 319–326 (2022)

然而，目前腦類器官的體內(nèi)研究集中在少數(shù)細胞的局部和急性反應(yīng)。移植的類器官如何接受外部刺激，并在受體中產(chǎn)生慢性功能反應(yīng)，尚未得到證實。但現(xiàn)有的檢測技術(shù)，無法支持同時在組織結(jié)構(gòu)和電生理兩個方面開展縱向研究。

為了回答上述問題，加州大學圣地亞哥分校Duygu Kuzum團隊和波士頓大學Anna Devor團隊開展合作。研究團隊結(jié)合透明微電極陣列和雙光子成像技術(shù)，對移植到成年小鼠脾后皮質(zhì)（retrosplenial cortex）的人腦類器官進行縱向的多模態(tài)監(jiān)測。2022年12月26日，相關(guān)成果以《Multimodal monitoring of human cortical organoids implanted in mice reveal functional connection with visual cortex》為題目，發(fā)表在Nature communications雜志上。

圖片來源：Nat Commun 13, 7945 (2022)

類器官和微電極陣列共植入

可以對類器官移植物進行縱向監(jiān)測

Duygu Kuzum團隊和Anna Devor團隊曾合作開發(fā)了一種透明的石墨烯微電極，實現(xiàn)了雙光子顯微鏡、光遺傳學刺激和皮層記錄在體內(nèi)的無串擾集成，相關(guān)成果于2018年發(fā)表在Nature communications雜志上。本文中，合作團隊沿用了上述石墨烯微電極技術(shù)，以此來記錄移植的腦類器官及周圍宿主組織的電信號和光學信號。

 

微電極陣列結(jié)構(gòu)示意圖

圖片來源：Nat Commun 9, 2035 (2018).

團隊首先重組人體皮膚纖維細胞并獲得hiPSCs。誘導hiPSCs產(chǎn)生腦類器官并培養(yǎng)7-9周后，根據(jù)尺寸和形狀，挑選其中的單個腦類器官。團隊選擇8-12周齡的NOD/SCID小鼠為受體，將人腦類器官植入左脾后皮質(zhì)（left retrosplenial cortex, RSC），然后將石墨烯微電極置于其上。團隊還利用3D打印技術(shù)制作了一種帽子，用于保護電極上的線路。術(shù)后恢復一周后，每兩周對小鼠進行電生理檢測，整個實驗持續(xù)8-11周。

 

類器官和微電極陣列共植入示意圖

圖片來源：Nat Commun 13, 7945 (2022)

類器官移植物對感覺刺激產(chǎn)生神經(jīng)反應(yīng)

研究團隊首先通過施加視覺刺激，研究腦類器官能否對感官刺激產(chǎn)生功能性響應(yīng)，并記錄隨之而來的電響應(yīng)。團隊提出假設(shè)，只有當類器官與宿主的視覺皮層組織整合后，才會開始對視覺刺激產(chǎn)生反應(yīng)。

 

研究人員在實驗小鼠的右眼前放置了一個光纖耦合的白光LED燈，該設(shè)備發(fā)出的光脈沖可以引發(fā)刺激誘導的電反應(yīng)。之后在類器官以及接近視覺皮層的皮層通道中都清晰地檢測到視覺刺激反應(yīng)。從類器官植入3周后，一直到實驗結(jié)束，研究人員在電極通道中確實觀察到了局部場電位（local field potentials, LFP），說明類器官植入物與周圍皮層組織建立突出連接，并接受小鼠大腦的功能輸入。

刺激誘發(fā)類器官和大腦皮層的局部場電位記錄

圖片來源：Nat Commun 13, 7945 (2022)

感覺刺激下

多單元活動發(fā)生調(diào)節(jié)

接著，團隊研究了類器官的放電活動（spiking activity），是否受周圍皮層神經(jīng)活動調(diào)節(jié)。由于多單元活動（Multi-unit activity, MUA）可以反映局部神經(jīng)元放電情況，研究人員在0.5–3 kHz帶通濾波數(shù)據(jù)中對多單元活動進行評估。研究人員在腦類器官和小鼠大腦皮層中，分別選擇了2個代表性的通道（類器官：O1和O4，小鼠：C2和C7）。在所有通道中，都觀察到自發(fā)的多單元活動。而且當視覺刺激開始后，在類器官和小鼠大腦皮層中，都觀察到多單元活動的增加。

類器官和大腦皮層的多單元活動

圖片來源：Nat Commun 13, 7945 (2022)

與宿主皮層相比

移植的類器官對麻醉的反應(yīng)不同

研究人員進一步假設(shè)，類器官移植物主要接受局部信號輸入，而像來自丘腦核和神經(jīng)調(diào)節(jié)中心的長距離投射則不存在。由于麻醉已被證明會影響到大腦皮層的長距離投射活動，因此團隊用1.5%異氟烷麻醉小鼠后，觀察類器官與周圍宿主皮層的自發(fā)神經(jīng)活動的變化。

 

與周圍皮質(zhì)相比，異氟醚麻醉導致類器官神經(jīng)元活性顯著降低。而且在清醒狀態(tài)下，類器官活性通常低于周圍皮層，對特定頻帶也沒有選擇性。結(jié)果顯示，類器官受局部神經(jīng)元支配，但缺乏長程投射。

用1.5%異氟烷麻醉小鼠后，

分析類器官和小鼠大腦的局部場電位

圖片來源：Nat Commun 13, 7945 (2022)

類器官移植物體內(nèi)血管化

并與周圍皮質(zhì)整合

研究人員運用體內(nèi)雙光子成像和免疫染色技術(shù)，對類器官移植物與周圍宿主組織的整合情況進行了觀察。

血管化一直是類器官構(gòu)建中的難點問題，在類器官植入的9到10周后，對小鼠注射血管內(nèi)示蹤劑Alexa Fluor 680葡聚糖。通過雙光子顯微鏡，發(fā)現(xiàn)類器官植入?yún)^(qū)域都含有小鼠脈管系統(tǒng)。而且與周圍皮質(zhì)相比，類器官區(qū)域的血管密度較低。

 

類器官血管化的體內(nèi)成像

圖片來源：Nat Commun 13, 7945 (2022)

在類器官植入后的8到11周處死動物，并對大腦進行免疫組化染色，檢測和分析人細胞（NM-95）、內(nèi)皮細胞細胞（CD31）和神經(jīng)元核（NeuN）。類器官植入?yún)^(qū)域顯示NM-95陽性，說明植入細胞在整個實驗周期中都存活了下來。而且，部分NM-95陽性細胞發(fā)生了細胞遷移。與雙光子顯微鏡觀察結(jié)果一致的是，研究人員也觀察到了穿過類器官植入物的血管內(nèi)皮細胞。通過NeuN和蘇木精共染，發(fā)現(xiàn)類器官移植物有約48%的細胞具有神經(jīng)元表型。

類器官血管化的免疫染色

圖片來源：Nat Commun 13, 7945 (2022)

下一步的研究方向

本項研究中開發(fā)的實驗裝置，為研究發(fā)育性腦疾病背后的人類神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)水平功能障礙提供了前所未有的機會。接下來，研究團隊需要構(gòu)建神經(jīng)疾病模型，整合鈣成像分析，并對類器官神經(jīng)元的放電活動進行可視化。

Duygu Kuzum在接受采訪時表示，未來干細胞技術(shù)一定會和神經(jīng)記錄技術(shù)結(jié)合，用于多個腦疾病研究場景。比如：在生理條件下構(gòu)建疾病模型，基于患者來源類器官驗證特定治療方式，評估類器官修復特定丟失、退化或受損腦區(qū)的潛力。

雖然目前人腦類器官的功能過于原始，但隨著人腦類器官移植相關(guān)研究的增加，類器官移植是否會影響動物腦功能或者動物行為值得關(guān)注。《猩球崛起4》的編劇，是不是可以考慮一下，融入當下這個熱門話題？

參考資料：

1.Revah, O., Gore, F., Kelley, K.W. et al. Maturation and circuit integration of transplanted human cortical organoids. Nature 610, 319–326 (2022).

2.Wilson, M.N., Thunemann, M., Liu, X. et al. Multimodal monitoring of human cortical organoids implanted in mice reveal functional connection with visual cortex. Nat Commun 13, 7945 (2022).

3. Thunemann, M., Lu, Y., Liu, X. et al. Deep 2-photon imaging and artifact-free optogenetics through transparent graphene microelectrode arrays. Nat Commun 9, 2035 (2018).

4.https://medicalxpress.com/news/2022-12-human-brain-organoids-implanted-mouse.html