RNA病毒包括多種致病病原，對(duì)人類健康構(gòu)成威脅。RNA病毒的基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程需要自身編碼的依賴RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）來(lái)主導(dǎo)完成。該過程經(jīng)歷引發(fā)（initiation）、延伸（elongation）和終止（termination）階段，由數(shù)以千計(jì)的核苷酸添加循環(huán)（nucleotide addition cycle，NAC）組成。該循環(huán)的機(jī)制不僅是了解RNA病毒本質(zhì)特征的重要內(nèi)容，而且是發(fā)展針對(duì)RdRP的抗病毒策略的重要依據(jù)。現(xiàn)有關(guān)于病毒RdRP的研究表明，每個(gè)NAC經(jīng)歷四個(gè)步驟：反應(yīng)底物NTP進(jìn)入RdRP活性中心；RdRP活性中心關(guān)閉（active site closure）；核苷酸轉(zhuǎn)移（nucleotidyl transfer）反應(yīng)發(fā)生（產(chǎn)物RNA的3’-末端添加一個(gè)核苷酸）；RdRP向下一位模板核苷酸轉(zhuǎn)位（translocation）從而開啟下一輪循環(huán)。過去十余年間，結(jié)構(gòu)生物學(xué)與酶學(xué)研究已基本完整勾勒出該NAC的機(jī)制，但始終未能準(zhǔn)確獲得催化反應(yīng)（步驟3）即將發(fā)生時(shí)的RdRP結(jié)構(gòu)信息，因此對(duì)于哪些氨基酸殘基在催化反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用存在爭(zhēng)議。

 

中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所研究員龔鵬團(tuán)隊(duì)長(zhǎng)期從事病毒RdRP催化機(jī)制研究。近期，該團(tuán)隊(duì)通過在腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71）RdRP-RNA復(fù)合物晶體浸泡實(shí)驗(yàn)中的多方嘗試，解析了高度接近催化反應(yīng)發(fā)生狀態(tài)的RdRP晶體結(jié)構(gòu)（圖A，PDB編號(hào)：7W9S，分辨率2.5埃），發(fā)現(xiàn)位于RdRP基序D附近的一個(gè)賴氨酸殘基K360與結(jié)構(gòu)中底物CTP的g-磷酸存在近距離相互作用（3.3埃）。在與EV71同為腸道病毒的脊髓灰質(zhì)炎病毒的前期研究中，等同的K359殘基被認(rèn)為直接參與催化反應(yīng)和其中的質(zhì)子轉(zhuǎn)移過程，而上述晶體結(jié)構(gòu)中觀測(cè)到的近距離相互作用進(jìn)一步提示了這種可能性。據(jù)此，該團(tuán)隊(duì)選取了EV71 RdRP的K360殘基和另一個(gè)與CTP的磷酸基團(tuán)存在相互作用的基序F精氨酸殘基R174為突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)了系列突變體，利用酶學(xué)方法對(duì)野生型RdRP和突變體的單步延伸速率常數(shù)和CTP米氏常數(shù)（圖B）、RdRP延伸狀態(tài)（elongation）和延伸前狀態(tài)（pre-elongation）下催化的pH依賴性等多種參數(shù)和性質(zhì)進(jìn)行了表征。結(jié)果表明，K360位點(diǎn)的突變降低了催化效率，且在延伸和延伸前狀態(tài)下都能影響RdRP的pH依賴特性，而R174位點(diǎn)的突變所造成的影響與K360類似且能額外降低底物CTP的親和力。這些數(shù)據(jù)表明K360和R174均直接參與催化反應(yīng)，但這兩個(gè)殘基是否直接參與質(zhì)子轉(zhuǎn)移有待進(jìn)一步取證。上述成果是該團(tuán)隊(duì)繼解析RdRP活性中心部分關(guān)閉結(jié)構(gòu)（對(duì)應(yīng)NAC步驟2）和揭示不對(duì)稱轉(zhuǎn)位現(xiàn)象（對(duì)應(yīng)NAC步驟4）（PNAS 2016；Nature Communications 2020）等NAC系列工作后的又一成果（對(duì)應(yīng)NAC步驟3），闡明了該循環(huán)的全過程機(jī)制（圖C、動(dòng)圖）。

 

相關(guān)研究成果在線發(fā)表在《核酸研究》（Nucleic Acids Research）上。研究工作得到國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金、湖北省江夏實(shí)驗(yàn)室生物安全科技重大項(xiàng)目等的支持。